CcR4-Not复合体通过去除mRNA的多聚poly(A)调控真核生物mRNA的稳定性和翻译过程。 RNA结合蛋白通过与CcR4-Not和mRNA的相互作用决定CcR4-Not发挥功能的核酸序列特异性，但是其中的机制并不完全清楚。本文中我们重构了富含 AU 元素（ARE）和 Pumilio 反应元件（PRE）的 RNA 加速和选择性去腺苷酸化的过程。我们发现裂殖酵母中三联四联体蛋白（Tristetraprolin/TTP）和Pumilio/Puf的同源物（Zfs1 和 Puf3）通过低复杂度序列内的多个区域与 Ccr4-Not 相互作用，表明一种多向的界面，这种界面超出了先前定义的互作方式。通过一种可以同时检测不同的RNAs多聚尾（PolyA)去除的双色检测法，我们证明了Puf3能够区分具有非常相似序列的不同RNAs。
结合动力学分析表明这种区分能力是由于解离常数的差异。因此，在体内，序列是Puf3靶向，并造成mRNA不稳定性的一个主要决定因素，能够用于靶向mRNA的预测。
在真核生物中，缩短或去除mRNA poly(A)尾巴，能够抑制基因表达。Ccr4-Not复合体是一个保守的去腺苷酸化酶，能够启动细胞质中mRNA的降解并通过释放poly(A）结合蛋白（Pab1/PABPC1)抑制翻译。
展开剩余92%Ccr4-Not包含七个核心亚单位，包括两个poly(A)特异性核酸外切酶，Ccr4/CNOT6/CNOT6L以及Caf1/Pop2/CNOT7/CNOT8，它能够通过RNA结合蛋白和RNA诱导的沉默复合物（RISC）被特异性募集到mRNA上。
RNA结合蛋白，例如Pumilio/Puf和Tristetraprolin/TTP能够识别mRNA的序列，并结合Ccr4-Not靶向RNAs进行去腺苷酸化。因此需要被RNA结合蛋白抑制和降解的转录组是由其整个转录组的结合基序的分布确定的，通常包括一组编码功能性相关蛋白的mRNA。
一个简单的控制蛋白产生的方式是增加或降低信使mRNA的数量，具有活性的细胞有很多种方式实现这个目的。一种方法涉及到mRNAs本身的密码子重建。mRNAs能够携带短的基因序列，启动它们自身的降解，被称为“去稳定化基序”。这些mRNA内部的序列能够吸引一组称为Ccr4-Not的蛋白，这些蛋白可以缩短mRNA的末端，促进分子的降解。但是，Ccr4-Not是如何选择待降解的靶向mRNA的呢？为了寻找答案，Webster等通过纯化的分子重构了检测体系。该检测体系证明了先前的发现，一种被称为Puf3的蛋白能够在Ccr4-Not和mRNAs之间形成一种桥连。通过两色荧光染料标记不同的mRNAs, 显示了Puf3如何帮助细胞选择降解哪一个mRNA分子，Puf3能够帮助Ccr4-Not从混合的分子中选择特定的mRNA，其能够在单个遗传密码水平上区分不同的mRNA序列。
近期，在斑马鱼胚胎发育过程中鉴定了三种序列元件能够促进mRNA的去稳定化：the Pumilio-response element (PRE), the AU-rich element (ARE) and the miR-430 seed sequence。PRE-和ARE介导的mRNA去稳定化从酵母到人类是保守的，但是mRNA序列在种属中是不同的。位于Pumilio蛋白家族中的保守的RNA结合域能够识别PRE序列，已有报道证明Pumilio蛋白的RNA结合域和CNOT7/Caf1核酸外切酶具有直接的相互作用，但不清楚这是否是Ccr4-Not上唯一的互作位点。能够与人的PUM1和PUM2互作的PRE在编码信号通路和神经元突触的mRNA中发现。在酿酒酵母中有六个Pumilio蛋白。这些蛋白中，ScPuf3是与高等真核生物中的同源物最相关的蛋白。在酵母菌中与人类 PUM 最相似的蛋白质（Puf3）也含有定义这一额外选择性凹槽的残基，因此它被预测能够与包含上游胞嘧啶的序列结合。
酿酒酵母的Puf3是线粒体功能的一个关键调节子。与此一致的是，它的靶向mRNA编码位于线粒体内的蛋白，涉及到氧化磷酸化的信号通路。
人类细胞中，编码细胞因子和淋巴因子的不稳定mRNA含有9个核苷酸序列的ARE序列（(UUAUUUAUU），该序列被包含有tristetraprolin (TTP)的串联锌指蛋白识别。TTP通过CNOT1和CNOT9亚单位直接与Ccr4-Not结合，靶向包含ARE序列的转录体进行降解，进而削弱了细胞的免疫性应答。TTP磷酸化的发生是p38 MAPK信号通路的一部分，破坏了Ccr4-Not的募集。酿酒酵母的 Zfs1 蛋白与 TTP 具有同源性，并且能够识别相同的 RNA 基序。在酿酒酵母中还未发现Zfs1和Ccr4-Not的相互作用，不清楚与TTP相互作用的Ccr4-Not中的氨基酸序列在Zfs1中是否具有保守性。
在此，我们利用重组的酵母蛋白对包含 PRE 和 ARE 的 RNA 进行了加速且选择性的去腺苷酸化处理。我们发现 Puf3 和 Zfs1 能够作为分子连接体，在体外诱导 Ccr4-Not 对靶向RNA 进行加速且选择性的去腺苷酸化，对 Puf3与RNA结合的生化和生物物理分析显示其具有高度的序列选择性。相应地，在酿酒酵母中，RNA的序列质量是 Puf3 在体内稳定结合 RNA的关键决定因素。总之，我们的研究结果表明，通过对RNA“序列质量”的详细分析，可以更深入地理解 RNA 结合蛋白的调控网络。
结果
01
Puf3和Zfs1在体外能够促进mRNA去腺苷酸化
为了验证在RNA结合蛋白存在的情况下，细胞具有底物选择性的去腺苷酸化，我们通过重组蛋白重构这一过程。全长Zfs1和Puf3蛋白在N端与麦芽糖结合蛋白（MBP)融合重组表达，完整的重组七亚基Ccr4-Not蛋白已按照先前的方法纯化出来。Pull-down检测表明Puf3和Zfs1能够与纯化的Ccr4-Not相互作用（请见Figure 1）。通过一个短的RNA底物模型，发现去腺苷酸化能够在单核苷酸分辨率水平被观察，并可以被精确的定量。为了验证是否Puf3和Zfs1在体外能够促进Ccr4-Not的去腺苷酸化活性，我们设计了一个包含能够分别被Puf3或Zfs1识别（PRE UGUAAAUA, 或ARE UUAUUUAUU）的RNA模式底物（请见Figure 1）。这些基序被置于合成的23个核苷酸序列中，在上游具有一个30个腺苷酸的多聚poly(A)尾。电泳迁移率测定结果表明puf3和Zfs1能够稳定的与靶向RNA结合（请见Figure 1)。在体外，Ccr4-Not能够去除Puf3和Zfs1底物RNA的多聚腺苷酸尾。Puf3和Zfs1能够促进它们的靶向RNAs的去腺苷酸化：在Puf3缺失时，从包含PRE的RNA中去除poly(A)尾大约需要32分钟，然而，在Puf3存在时，反应过程少于2分钟（请见Figure 1A）。因此，加入Puf3能够提高去腺苷酸化速率超过20倍。Zfs1同样能够提高底物去腺苷酸化率少于2分钟（请见Figure 1B)。
Puf3和Zfs1能够促进RNA的去腺苷酸化
02
Puf3 和 Zfs1 通过较长的低复杂度序列募集 Ccr4-Not 蛋白
如上述提到，Ccr4-Not与 Pumilio/TT蛋白之间特定的相互作用已被证明，为了解析加速的去腺苷酸化机制以及Puf3和Zfs1不同部分的功能，我们对这些蛋白做了一系列的突变及截短，并测试它们去腺苷酸化的能力。首先，我们测试了是否RNA结合域（Puf3 PUM 和Zfs1TZF）能够影响去腺苷酸化（请见Figure 2)。Puf3 PUM的加入能够促进轻微的加速去腺苷酸化（请见Figure 2A)。因为Puf3 PUM的刺激程度大大低于全长的Puf3, 在Pumilio结构域外的区域在募集Ccr4-Not的过程中发挥着重要作用。有趣的是，Zfs1 TZF是抑制去腺苷酸化的（请见Figure 2A)。为了明确与RNA的结合对Puf3和Zfs1的功能是必需的，我们产生了在RNA结合界面具有突变的全长蛋白（Puf3Mut : Y449A/Y671A和 Zfs1Mut : F349A/F387A）。和野生型相比，这些蛋白在结合底物RNA以及加速去腺苷酸化上能力都极大的降低了（请见Figure 2A)。总的说来，这些数据表明Puf3与Zfs1的刺激效应依赖于与RNA的结合，但仅仅具有RNA结合域是不足够的。除了C端的RNA结合域，Puf3和Zfs1都包含一个较长的低复杂度的N端区域，可预测是主要的无序区（请见Figure 2B)。我们假设在Puf3和Zfs1低复杂度区域内的短序列能够与Ccr4-Not相互作用，我们产生了一系列的截短序列，并检测对Ccr4-Not的去腺苷酸化活性的影响（请见Figure 2B)。
对于这两种蛋白质而言，没有单一的截短序列能够单独对去腺苷酸化产生刺激作用。相反，随着低复杂性序列长度的缩短，对去腺苷酸化速率的刺激作用也会减弱。因此，很可能是在低复杂性区域分布的多个序列元件与 Ccr4-Not 相互作用。
Puf3和Zfs1与Ccr4-Not相互作用检测
03
Puf3和Zfs1诱导Ccr4-Not底物选择性去腺苷酸化
已经证明，Puf3和Zfs1能够提高Ccr4-Not的活性，我们想要进一步明确它们是否对底物的选择性也是足够的。我们首先检测能够被每个蛋白识别的靶向序列是否对于提高去腺苷酸化是必需的。将Puf3和Zfs1对它们的靶向RNA的效应与对非靶向RNA的作用相比较，我们发现，每一种蛋白都能够刺激不包含其靶向序列的RNA发生去腺苷酸化（请见Figure 3A)。去腺苷酸化的速率定量表明，靶向去腺苷酸化大约是无靶向序列去腺苷酸化速率的3-4倍，无靶向序列反过来比不加入RNA结合蛋白的去腺苷酸化速率快2-5倍（请见Figure 3）。因此，正确的靶向RNA序列有助于RNA结合蛋白在体外提高去腺苷酸化率，但并不绝对需要。由于含有一个突变的RNA结合域的Puf3蛋白仍旧能够促进去腺苷酸化，Ccr4-Not被Puf3低复杂域的别构激活可能有助于无靶向序列的去腺苷酸化速率的提高（请见Figure 2）。然而，不能与RNA结合的突变的Zfs1未能够提高去腺苷酸化率。因此，别构激活可能不是一个普遍的机制。取而代之，我们假设在体外实验中无结合靶向的去腺苷酸化刺激是由于无靶向的RNA结合，为了明确全长的Puf3和Zfs1与底物RNA结合的亲和性，我们用含有Puf3或Zfs1靶向序列和30个碱基的多聚腺苷酸的RNA进行了荧光极化RNA结合检测（请见Figure 3B)。每一种RNA结合蛋白都以极高的亲和性与其各自的靶向RNA分子结合（KD=1-2nM)。相反，Puf3与无靶向ARE序列结合的亲和性是120nM, 而Zfs1与无靶向PRE序列结合的亲和性为850nM。在上述两种蛋白的结合中，poly(A)结合的亲和性都低于靶向RNA序列约100倍。因此，Puf3和Zfs1与RNA的结合都是选择性的，靶向序列RNA的结合亲和性大于无靶向序列约100倍。同时，Puf3和Zfs1以nM级的亲和性与无靶向RNA序列结合，这可以解释它们刺激无靶向序列RNA去腺苷酸化的原因。
我们假设Puf3和Zfs1将从混合的靶向和非靶向序列中选择它们的靶向结合序列，并促进它们的去腺苷酸化。为了验证这个假设，我们设计了一个检测体系，直接的检测Ccr4-Not的选择性去腺苷酸化。两种多聚腺苷酸化的RNA底物用不同的荧光探针进行标记，并在添加Ccr4-Not以及去腺苷酸化活性分析之前，对它们进行化学计量定量。相同的凝胶因此可用于检测fluorescein标记的Puf3靶向底物以及Alexa647标记的Zfs1靶向底物，各自呈现蓝色和红色。在这两种荧光检测中，未添加蛋白时，Ccr4-Not对Zfs1靶向的RNA去腺苷酸化速率比Puf3靶向的RNA快3倍。
随之，我们使用三种不同浓度的Puf3或Zfs1，RNA浓度为100nM，进行一系列的反应。Puf3或Zfs1为50nM时，仅仅靶向RNA的去腺苷酸化被加速（请见Figure 3D)。一部分靶向RNA未受到影响，与RNA结合蛋白的不完全结合相关；Puf3或Zfs1为250nM时，所有靶向RNA的去腺苷酸化被显著增加，但非靶向RNA未受到影响（请见Figure 3D）。因此，Puf3和Zfs1促进了序列选择性的，加速的去腺苷酸化。当过量的RNA结合蛋白加入的时候（1000nM），选择性消失，所有的RNA都被去腺苷酸化（请见Figure 3D)。
Puf3和Zfs1介导了Ccr4-Not选择性的RNA去腺苷酸化
04
Puf3能够区分非常相似的靶向RNA序列
细胞中，存在具有非常相似序列的RNA，而RNA结合蛋白能够区分这些相似性RNA，表现出靶向的偏好性。例如，酿酒酵母的Puf3蛋白的RNA靶点与 ScPuf5/Mpt5 的靶点在核心8个核苷酸组成的基序内有两个核苷酸的位置存在差异（请见Figure 4A)。我们已知，Puf3在较高的浓度时能够与无靶向序列RNA结合，我们研究了是否Puf3在体外能够区分ScPuf3和ScPuf5之间非常相似的序列。我们通过荧光极化实验检测RNA的结合，发现S. pombe 的Puf3 PUM蛋白能够以高亲和力与 ScPuf3 靶标以及 ScPuf5 靶标相结合（请见Figure 4A)。与ScPuf3基序结合的亲和性比ScPuf5基序高约2倍，但是两个序列结合的亲和性都是在pM级别。令人吃惊的是，用100nM的Puf3进行去腺苷酸化的活性检测，我们发现ScPuf3的靶标优先于ScPuf5靶标被选择去腺苷酸化（请见Figure 4B)。因此，Puf3能够区分非常相似的RNA序列，选择它们被Ccr4-Not进行去腺苷酸化。选择去腺苷酸化仅仅发生在一个较窄的Puf3浓度范围，在这个范围内，Puf3蛋白的量少于或等于ScPuf3靶向RNA的量（请见Figure 4B,C)。更少的Puf3(50nM Puf3），并不是所有的ScPuf3靶向RNA能够迅速的发生去腺苷酸化。相反，当过量的Puf3存在时（200nM Puf3),ScPuf3和ScPuf5靶向RNAs都能够迅速的发生去腺苷酸化。我们进行了RNA EMSAs检测，发现Puf3刺激去腺苷酸化的能力与RNA结合相关：只有当 Puf3 蛋白的摩尔量超过 ScPuf3 目标 RNA 时，才会与 ScPuf5 目标 RNA 发生结合（请见Figure 4D)。因此，仅仅当Puf3蛋白的浓度在一个较窄的范围时，Puf3才会完全的以及选择性的结合，Ccr4-Not才会选择性的去腺苷酰化。我们接着检测Puf3是否能够区分非常相似的序列。被ScPuf3识别的8个核苷酸序列中，第5个位置是最易变的，A和U被认为是可以容忍的。这是人类同源物PUM1和PUM2所共有的特性。先前的实验表明，RNA基序在第5位是A（现在称为ScPuf3-target(5A))。通过双色去腺苷酸化检测，我们鉴定了是否在位置5有一个A或U的偏向性，发现ScPuf3-target(5A) RNA比ScPuf3-target(5U) RNA更易发生去腺苷酸化（请见Figure 4E)。因此，Puf3 具有很强的能力，能够区分其目标基序当前定义范围内的不同序列。位置5上的核苷酸序列的特性将会影响“基序质量”，Puf3以优先级的方式与不同质量的基序发生相互作用。
Scpuf3能够区分相似的RNA基序
05
SwitchSENSE技术检测Puf3选择性结合RNA的动力学基础
为了理解Puf3选择性结合RNA，能够区分序列非常相似的RNA的机制，我们通过SwitchSENSE技术分析了分子结合动力学。可摆动的DNA纳米杆与RNA连接，其RNA基序包括以下进行腺苷酸化反应的三种序列：ScPuf3-target(5A), ScPuf3-target(5U) 和ScPuf5-target。我们测量了裂殖酵母中的Puf3 PUM结合到每个RNA基序上的结合（Kon)和解离（Koff）动力学。多聚腺苷酸做为阴性对照。结合率遵循相同的偏向性结合模式，已经被去腺苷酸化检测及EMSA验证（请见Figure 5A)：与ScPuf3-target(5A)的结合比与ScPuf3-target(5U)的结合快25%，比与ScPuf5-target的结合快3倍。与多聚腺苷酸的结合更低（约7倍）。因此，RNA序列影响了Puf3结合率。然而，重要的是，所有的序列都可以迅速的结合：当浓度在20nM时，与所有RNA的结合都发生在数秒范围（请见Figure 5A)。
当我们研究解离率时，我们发现 Puf3 在 ScPuf3 目标序列中第 5 位位置与 A 结合的持续时间是与 U 结合在该位置时的两倍，并且是与 ScPuf5 目标 RNA 结合时的约三倍（请见Figure 5B)。从多聚腺苷酸上的解离率快100倍。因此，Puf3的解离率也反映了序列选择的偏向性。结合我们的结合与解离测量结果，Puf3 的序列选择性结合预计是通过对所有 RNA 进行快速采样，并在具有更高质量的RNA序列上进行较慢的解离来实现的。
RNA基序质量影响Puf3与其结合的动力学
发布于：上海市